建库与外显子捕获
测序仪读不了一整条染色体，只能读两端带接头的短 DNA 片段。建库就是把基因组 DNA 变成这样一批片段；外显子捕获再从中挑出编码区，让只占基因组约 1–2% 的外显子拿到大部分测序量。插入片段长度、重复率、在靶率和捕获区大小都在这两步定型，其中捕获区大小还会成为 TMB 的分母。
建库：把 DNA 变成测序仪认得的分子
第一步是打断：用超声或酶切把基因组 DNA 切成几百 bp 的片段，WES 通常把主峰控制在约 150–250 bp。接着做末端修复，把参差的断端补平，再在 3′ 端加一个 A，便于和带 T 突出端的接头连接。接头上有测序引物的结合位点和样本 index，多个样本因此可以混在一起上机，测完再按 index 拆分。最后用 PCR 把连好接头的分子扩增到足够的量。
PCR 会把同一个原始分子复制成多份，它们在测序时被读到不止一次，这就是 PCR 重复。DNA 投入越少、损伤越重，独立的原始分子就越少，也就是文库复杂度越低，同样的测序量里重复越多。
杂交捕获：从全基因组里钓出外显子
建好的文库覆盖整个基因组。捕获试剂盒提供大量生物素标记的探针（RNA 或 DNA），序列与外显子互补。文库变性成单链后与探针杂交，再加入包被链霉亲和素的磁珠：生物素与链霉亲和素紧密结合，磁铁把带着探针的片段吸住，没有结合的非目标片段被洗掉。洗脱下来的片段再做一轮 PCR，就得到可以上机的外显子文库。
捕获并不完美。有的片段只和探针搭上一部分，有的被非特异地带下来，测序时就成了脱靶 reads。GC 含量过高或过低的外显子，杂交和扩增效率都偏低，覆盖会明显变浅。
捕获区大小：TMB 的分母
每个试剂盒都附带一个目标区 BED 文件，列出设计要捕获的区域，它们的总长就是捕获区大小。常见外显子试剂盒约 30–60 Mb，差别来自探针设计、是否包含 UTR，以及目标两侧延伸多少。同一个肿瘤用不同试剂盒测，能数到的突变数不同，所以 TMB 要除以捕获区大小（第 8 章）。更严格的分母是实际可检出的区域，也就是肿瘤和正常样本都覆盖足够的那一部分。
常见误区
- 以为外显子都被均匀测到。 高 GC 的第一外显子、与假基因高度同源的区域常常覆盖不足，某个基因“没有突变”可能只是没测到。
- 用设计区大小代替实际可检出区。 覆盖不足的区域检不出突变，却仍算在分母里，会低估 TMB。
- 靠加测弥补低复杂度文库。 复杂度不够时，加测换来的多是重复，有效深度涨不上去，应考虑增加投入量或重新建库。