生信从湿到干 · 交互式动画教程

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指标词典

每个指标三件事：它在湿实验里从哪一步产生，在数据里代表什么，通常落在什么范围。

单细胞 RNA-seq

细胞活率

湿实验来源: 上机前用台盼蓝或荧光染料（如 AO/PI）计数得到的活细胞百分比，反映解离、冻存复苏和等待时间对细胞膜的损伤。
数据含义: 活率低意味着破损细胞多、游离 RNA 多：高 percent.mt 的细胞增多，环境 RNA 背景升高，Fraction Reads in Cells 下降。
常见范围: 越高越好；许多平台以 70%–90% 以上作为接收标准，具体因平台和样本类型而异。冻存样本通常低于新鲜样本。
相关章节: 组织解离

解离应激 `percent.diss`

湿实验来源: 37 °C 酶解和机械处理时细胞仍在转录，即早基因和热休克基因（FOS、JUN、EGR1、HSPA1A 等）被迅速诱导。这是实验造成的，不是组织里原本的状态。
数据含义: 一批细胞共同高表达应激基因，可能自成一簇或主导某个主成分。可用应激基因集打分识别（如 van den Brink 等 2017 年的基因列表，常记作 percent.diss 或模块分）。
常见范围: 没有通用阈值。缩短处理时间、低温蛋白酶解离或改做单细胞核测序（snRNA-seq）可以减轻。
相关章节: 组织解离 · 聚类

线粒体基因比例 `percent.mt`

湿实验来源: 细胞膜在解离、冻融或等待中破损时，胞质 mRNA 漏出，而被线粒体膜包住的线粒体转录本留下，比例因此升高；凋亡和应激细胞也会升高。
数据含义: 每个细胞中来自线粒体基因（人类 MT- 开头，小鼠 mt-）的 UMI 占比。高值常伴随低 UMI 数和低基因数，提示破损或濒死细胞。
常见范围: Seurat 的 pbmc3k 教程用低于 5%；PBMC 常见阈值 5%–10%；心、肾、肌肉等代谢旺盛组织本底更高；单细胞核数据通常很低，偏高反而提示混入胞质。阈值应按组织和数据自适应（如中位数 + 3 MAD），并按样本计算。
相关章节: 组织解离 · 质控

核糖体蛋白基因比例 `percent.ribo`

湿实验来源: 没有单一的湿实验来源：主要由细胞类型和状态决定（例如静息淋巴细胞较高），也受环境 RNA 和细胞破损程度影响。
数据含义: 来自核糖体蛋白基因（RPS、RPL 开头）的 UMI 占比。多用于描述和排查，一般不作为硬过滤条件。
常见范围: 随细胞类型变化很大，不设统一阈值；整个簇异常偏高或偏低时再追查原因。
相关章节: 质控

血红蛋白基因比例 `percent.hb`

湿实验来源: 红细胞去除不彻底（PBMC 的密度梯度分离或裂红步骤），或者被裂解的红细胞释放的血红蛋白 mRNA 混进悬液，成为环境 RNA。
数据含义: HBA1、HBA2、HBB 等基因的 UMI 占比。个别细胞很高可能是残留红细胞（或红系前体）；所有细胞普遍偏高则提示环境 RNA 污染。
常见范围: PBMC 和大多数组织中应很低；全血、骨髓和出血组织更高，需结合样本类型判断。
相关章节: 组织解离 · 质控

环境 RNA（soup）

湿实验来源: 解离、离心和等待过程中破裂的细胞把 mRNA 释放进悬液；这些游离 RNA 会和细胞一起被包进每一个液滴，包括空液滴。
数据含义: 叠加在每个细胞上的一层背景表达，其组成与空液滴的表达谱相同；表现为高丰度基因出现在不该表达它的细胞里（如 PBMC 中 T 细胞带有 LYZ 或 HBB）。可用 SoupX、CellBender、DecontX 等估计并扣除，这些工具需要原始（未过滤）矩阵。
常见范围: 随样本质量变化很大。Fraction Reads in Cells 偏低、条形码排序曲线的空液滴平台偏高，都是环境 RNA 多的信号。
相关章节: 组织解离 · Cell Ranger · 标志基因与细胞注释

GEM（凝胶珠乳液液滴） `GEM`

湿实验来源: 在微流控芯片的交汇处，细胞悬液（含逆转录试剂）、凝胶珠和油汇合，形成一个个油包水液滴。每个液滴是一个独立的反应室：凝胶珠溶解释放引物，细胞裂解，逆转录在液滴内完成。
数据含义: 数据里的一个条形码对应一个液滴，而不是一个细胞：空液滴和装了两个细胞的液滴分别变成空条形码和双细胞。
常见范围: 为控制双细胞，细胞被稀释上样，所以绝大多数液滴不含细胞。每次运行的液滴数取决于芯片和试剂盒。
相关章节: 微流控液滴

凝胶珠

湿实验来源: 可溶解的水凝胶珠，表面连着大量相同结构的寡核苷酸引物：Illumina Read 1 引物序列 + 细胞条形码 + UMI + poly(dT)。同一颗珠子上的条形码全部相同，UMI 各不相同。
数据含义: 一颗珠子就是一个条形码。凝胶珠可变形、紧密排列，几乎逐个进入液滴，所以大多数液滴恰好有一颗珠子，条形码与液滴近似一一对应；偶尔两颗珠子进入同一液滴，会让一个细胞分裂成两个条形码。
常见范围: 珠子进入液滴近乎规则，不服从泊松分布；细胞则是随机进入的。珠子的具体占用率取决于芯片版本。
相关章节: 微流控液滴 · 细胞条形码、UMI 与逆转录

双细胞（多细胞液滴） `doublet_score`

湿实验来源: 细胞随机进入液滴（泊松分布）：上样越多，两个或更多细胞落进同一液滴的概率越高；悬液中没打散的细胞团块也会造成双细胞。
数据含义: 一个条形码里混着两个细胞的转录本：UMI 数和基因数偏高，同时表达两种细胞类型的标志基因（如 T 细胞 + 单核细胞）。异型双细胞可用 scDblFinder、DoubletFinder 等模拟方法识别；同型双细胞（同一类型的两个细胞）几乎无法从表达上识别。必须按样本（按捕获通道）运行。
常见范围: 大致随回收细胞数线性上升；经典 3′ v3/v3.1 说明书给出约每 1,000 个回收细胞 0.8%（回收 1 万个细胞约 7%–8%），以所用试剂盒说明为准。
相关章节: 微流控液滴 · 质控 · 标志基因与细胞注释

空液滴

湿实验来源: 细胞被稀释上样，绝大多数液滴只有凝胶珠和悬液、没有细胞；但悬液里的游离 RNA 一样会被捕获、打上条形码。
数据含义: 条形码排序曲线拐点以下的大量低 UMI 条形码，表达谱就是环境 RNA。Cell Ranger 和 EmptyDrops 依据 UMI 数以及与环境 RNA 谱的差异，把它们和真正的细胞区分开。
常见范围: 原始矩阵（raw_feature_bc_matrix）中的条形码数远多于细胞数，绝大多数是空液滴；它们是估计环境 RNA 的原料，不要丢掉原始矩阵。
相关章节: 微流控液滴 · Cell Ranger

细胞条形码 `CB`

湿实验来源: 凝胶珠寡核苷酸上的一段固定序列，同一颗珠子上全部相同、不同珠子各不相同；逆转录时被写进 cDNA 的一端，于是同一液滴里的所有分子都带上同一个“细胞地址”。
数据含义: Cell Ranger 用它把 reads 归到细胞：先与预先定义的白名单比对，允许校正 1 个错配。一个条形码对应一个液滴，不一定等于一个细胞（可能是空液滴或双细胞）。
常见范围: 3′ v3/v3.1：16 bp；3′ v2：16 bp；3′ v1（示例数据 pbmc3k 所用）：14 bp。
相关章节: 细胞条形码、UMI 与逆转录 · 建库与测序 · Cell Ranger

UMI（唯一分子标识符） `UMI`

湿实验来源: 凝胶珠寡核苷酸上紧跟条形码的一段随机序列，每条寡核苷酸各不相同。逆转录时每个 mRNA 分子拿到一个 UMI，之后 PCR 扩增出的所有拷贝都继承这个 UMI。
数据含义: 同一细胞、同一基因、同一 UMI 的 reads 合并计为一个分子，从而去掉 PCR 扩增不均带来的偏差；计数矩阵里的数值就是 UMI 数。Cell Ranger 会把与高丰度 UMI 只差 1 个碱基的 UMI 视为测序错误并合并。
常见范围: 3′ v3/v3.1：12 bp（4¹² ≈ 1,680 万种序列）；3′ v2 与 v1：10 bp（约 105 万种）。
相关章节: 细胞条形码、UMI 与逆转录 · 建库与测序 · Cell Ranger

poly(dT) 捕获 `poly(dT)`

湿实验来源: 引物末端的一串 T 与 mRNA 的 poly(A) 尾配对，作为逆转录的起点。转录本内部富含 A 的区段（包括内含子里的）有时也会被引发。
数据含义: 只有带 poly(A) 尾的 RNA 能被捕获（大多数 mRNA 可以，复制依赖型组蛋白 mRNA 等不行）；3′ 试剂盒的 reads 集中在转录本 3′ 端。内部引发产生的内含子 reads 是 RNA 速率分析中“未剪接”计数的主要来源之一。
常见范围: 定性性质，不随样本变化；只捕获到细胞内 mRNA 的一部分，因此低表达基因常常读到 0。
相关章节: 细胞条形码、UMI 与逆转录 · 进阶

样本 index

湿实验来源: 建库最后一步的 PCR 在文库两端加上 P5/P7 接头和短的 index 序列（i7，双 index 试剂盒还有 i5），使多个文库可以混在一起上机。
数据含义: 拆分 FASTQ（BCL Convert、bcl2fastq 或 cellranger mkfastq）时按它分样本；index 填错或 index 跳跃（index hopping）会让 reads 被分到错误的样本。
常见范围: 单 index 试剂盒为 8 bp，双 index 试剂盒 i7、i5 各 10 bp（依试剂盒）。在图案化流动槽上混合大量样本时，建议用唯一双 index。
相关章节: 建库与测序

Q30 碱基比例 `Q30`

湿实验来源: 测序仪碱基识别的质量，受簇密度、试剂和流动槽状态影响，与样本本身关系不大。
数据含义: Phred 质量值 ≥ 30（错误率 ≤ 0.1%）的碱基比例。Cell Ranger 分别报告条形码、UMI、RNA read 和样本 index 各段的 Q30。
常见范围: 依平台和读长而异，质量通常随循环数下降。Cell Ranger 对各段设有警告阈值（以所用版本文档为准）；条形码段质量差会直接拉低有效条形码比例。
相关章节: 建库与测序 · Cell Ranger

条形码排序图（knee plot）

湿实验来源: 曲线形状由上样细胞数、细胞活率和环境 RNA 的多少决定。
数据含义: 所有条形码按 UMI 数从高到低排序，双对数坐标作图：左侧高平台是细胞，陡降之后的长尾是空液滴。悬崖越陡，细胞和背景分得越清楚。
常见范围: 定性判断：拐点清楚、平台高为好；缓坡说明破损细胞或环境 RNA 多，细胞数估计不可靠。
相关章节: Cell Ranger

估计细胞数 `Estimated Number of Cells`

湿实验来源: 由上样细胞数和回收效率决定：上样的细胞只有一部分能被液滴捕获并成功生成带条形码的 cDNA。
数据含义: Cell Ranger 判定为细胞的条形码数。较新版本先按 UMI 数取明显的高 UMI 条形码，再用类似 EmptyDrops 的方法，把表达谱与环境 RNA 明显不同的低 UMI 条形码补回来。
常见范围: 应接近实验设计的目标回收数。回收效率依赖试剂盒，常见约为上样数的一半到三分之二；明显偏离提示计数误差、细胞团块或环境 RNA 过多导致细胞识别出错。
相关章节: 微流控液滴 · Cell Ranger

每细胞平均 reads 数 `Mean Reads per Cell`

湿实验来源: 由测序时分给这个文库的 reads 总量决定（流动槽的产出 ÷ 混在一起的文库数）。
数据含义: 总测序 reads 数 ÷ 估计细胞数。分子包括不在细胞里的 reads（空液滴、环境 RNA），所以环境 RNA 多时，它会高估细胞真正得到的深度。
常见范围: 10x 对 3′ 基因表达文库的最低建议约为每细胞 20,000 read pairs（以所用试剂盒说明为准）；测得更深能检出更多基因，但收益递减，参考测序饱和度。
相关章节: 建库与测序 · Cell Ranger

每细胞基因数中位数 `Median Genes per Cell`

湿实验来源: 取决于细胞本身的 RNA 含量和类型、捕获与逆转录效率（化学版本）以及测序深度。
数据含义: 判定为细胞的条形码中，检测到（UMI ≥ 1）的基因数的中位数，即 nFeature_RNA 的中位数。
常见范围: 强烈依赖细胞类型、化学版本和深度：PBMC 这类 RNA 含量低的小细胞明显低于大的上皮或肿瘤细胞；新化学版本高于 pbmc3k 所用的 v1。应与同组织、同化学的历史数据比较。
相关章节: Cell Ranger · 质控

每细胞 UMI 数中位数 `Median UMI Counts per Cell`

湿实验来源: 反映每个细胞被捕获并逆转录的 mRNA 分子数，由细胞大小与 RNA 含量、捕获效率和测序深度共同决定。
数据含义: 判定为细胞的条形码的 UMI 总数中位数，即 nCount_RNA 的中位数。
常见范围: 依细胞类型、化学版本和深度而异，没有通用合格线；与同组织、同化学的历史数据比较更有意义。
相关章节: Cell Ranger · 质控

测序饱和度 `Sequencing Saturation`

湿实验来源: 由文库复杂度（有多少独立分子被成功逆转录和扩增）与测序深度共同决定：复杂度低或测得深，同一个分子就会被反复测到。
数据含义: 1 −（去重后的 UMI 数 ÷ reads 数），即 reads 中来自已经见过的分子（同一条形码、UMI、基因）的比例。50% 意味着平均每个分子被测到两次。
常见范围: 没有统一合格线：饱和度低说明继续加测还能发现新分子；饱和度已高而基因数仍低，说明文库复杂度不足，加测帮助不大。
相关章节: 细胞条形码、UMI 与逆转录 · 建库与测序 · Cell Ranger

细胞内 reads 比例 `Fraction Reads in Cells`

湿实验来源: 主要反映环境 RNA 的多少：解离损伤、死细胞和裂解释放的 RNA 越多，落在空液滴条形码上的 reads 越多。
数据含义: 有效条形码且可信比对到转录组的 reads 中，落在被判定为细胞的条形码上的比例。偏低说明大量 reads 在 soup 里，或细胞识别有误。
常见范围: 10x 期望约 70% 以上，Cell Ranger 低于其阈值会给出提示（阈值以所用版本文档为准）。
相关章节: 组织解离 · Cell Ranger

有效条形码比例 `Valid Barcodes`

湿实验来源: 取决于凝胶珠寡核苷酸的合成质量和条形码段的测序质量；Read 1 质量差、文库结构异常或化学版本设置不对时下降。
数据含义: 条形码与白名单完全匹配、或校正 1 个错配后能匹配的 reads 比例；不合格的 reads 无法归到任何细胞。
常见范围: 10x 期望约 75% 以上（以 Cell Ranger 文档为准）；明显偏低时检查测序运行和化学版本是否匹配。
相关章节: 细胞条形码、UMI 与逆转录 · Cell Ranger

可信比对到转录组的比例 `Reads Mapped Confidently to Transcriptome`

湿实验来源: 取决于 RNA 质量和文库构成：RNA 降解、基因组 DNA 污染、基因间区 reads 多时下降；参考物种选错时会骤降。
数据含义: Read 2 唯一地比对到一个基因的 reads 比例，只有这些 reads 参与 UMI 计数。Cell Ranger 7 起默认把内含子 reads 也计入（include-introns）。
常见范围: 人、小鼠的高质量样本通常较高；是否计入内含子会明显改变数值，跨 Cell Ranger 版本比较时要注意。
相关章节: Cell Ranger

每细胞 UMI 总数 `nCount_RNA`

湿实验来源: 细胞的 RNA 含量（大小、类型、活性）× 捕获效率 × 测序深度；破损细胞因 mRNA 漏出而偏低，空液滴更低，双细胞偏高。
数据含义: Seurat 元数据中每个细胞所有基因 UMI 之和，也叫文库大小。
常见范围: 依细胞类型和深度而异；QC 中常在对数尺度上用中位数 ± 若干个 MAD 判断离群，并按样本计算。
相关章节: 质控 · 归一化

每细胞检测到的基因数 `nFeature_RNA`

湿实验来源: 与 UMI 总数同源，同时反映文库复杂度；空液滴和破损细胞偏低，双细胞偏高。
数据含义: 每个细胞中 UMI ≥ 1 的基因数。
常见范围: pbmc3k 的 Seurat 教程保留 200–2,500；其他数据（尤其是新化学版本）要按化学、深度和组织重新设定。
相关章节: 质控

归一化

湿实验来源: 无直接湿实验来源；它要校正的是液滴间捕获效率和测序深度造成的总量差异，同时也会抹掉细胞之间真实的 RNA 含量差异。
数据含义: 让不同细胞的表达可以比较。LogNormalize：每个细胞的计数除以总 UMI、乘 10,000、再取 log1p；SCTransform：用正则化负二项回归对深度建模，取 Pearson 残差。
常见范围: Seurat 默认缩放因子为 10,000（CP10k）。PCA 前的 ScaleData 再把每个基因中心化、缩放到单位方差。
相关章节: 归一化

高变基因

湿实验来源: 无直接湿实验来源；它反映的是细胞间的生物学差异（细胞类型、状态），叠加上技术来源的变异（采样噪音、解离应激基因、环境 RNA 中的高丰度基因）。
数据含义: 校正均值–方差关系之后方差仍明显偏高的基因（Seurat 的 vst 方法）。只用这些基因做 PCA，以突出生物学信号。
常见范围: Seurat 默认 2,000 个，常见取 2,000–3,000 个；数量是参数，不是事实。
相关章节: 高变基因与 PCA

主成分（PC） `PC`

湿实验来源: 无直接湿实验来源；前几个 PC 通常对应主要细胞类型的差异。如果某个 PC 由线粒体基因、应激基因或测序深度主导，说明技术因素在驱动变异。
数据含义: 基因表达的线性组合，按解释的方差从大到小排列；之后的邻居图、聚类和 UMAP 都在前若干个 PC 上计算。PC 的正负号是任意的。
常见范围: Seurat 默认计算 50 个；pbmc3k 教程用前 10 个。常用碎石图（elbow plot）辅助选择，宁多勿少。
相关章节: 高变基因与 PCA

k 近邻图（KNN / SNN）

湿实验来源: 无直接湿实验来源。
数据含义: 在 PC 空间里把每个细胞连到离它最近的 k 个细胞；Seurat 再按两个细胞邻居的重叠程度（Jaccard 指数）给连线加权，得到 SNN 图，供聚类使用。
常见范围: Seurat FindNeighbors 默认 k = 20。k 越大图越平滑，小群体越容易并进大群。
相关章节: 聚类

分辨率 `resolution`

湿实验来源: 无直接湿实验来源。
数据含义: Louvain / Leiden 模块度优化中的参数：越大，得到的簇越多、越细。它不对应任何生物学单位。
常见范围: Seurat 教程建议约 3,000 个细胞的数据取 0.4–1.2；pbmc3k 教程用 0.5。细胞越多，往往需要更高的分辨率。
相关章节: 聚类

UMAP `UMAP`

湿实验来源: 无直接湿实验来源；但按样本、nCount_RNA 或 percent.mt 给 UMAP 着色，可以看出某个结构是否由技术因素造成。
数据含义: 一种非线性降维，把高维的邻居关系画到二维：保留“谁和谁是邻居”，不保留簇与簇的距离、簇的大小和密度。只用于可视化。
常见范围: Seurat RunUMAP 默认 n.neighbors = 30、min.dist = 0.3；换随机种子或参数，图形会变。
相关章节: UMAP

t-SNE `t-SNE`

湿实验来源: 无直接湿实验来源。
数据含义: 另一种非线性降维，比 UMAP 更强调局部邻居，簇之间的相对位置更没有意义。
常见范围: 主要参数是 perplexity（常用 30）；同样只用于可视化。
相关章节: UMAP

标志基因

湿实验来源: 无直接湿实验来源；但环境 RNA 和双细胞会让标志基因出现在不该出现的簇里。
数据含义: 在一个簇中表达明显高于其他细胞的基因，用来推断簇的身份。Seurat 的 FindAllMarkers 默认用 Wilcoxon 秩和检验，逐个簇与其余所有细胞比较。
常见范围: 好的标志基因同时满足：avg_log2FC 大、pct.1 高、pct.2 低。
相关章节: 标志基因与细胞注释

平均 log2 倍数变化 `avg_log2FC`

湿实验来源: 无直接湿实验来源。
数据含义: 一个簇与其余细胞平均表达之比的以 2 为底的对数；1 表示约高 2 倍。Seurat 在归一化数据上计算，并加入伪计数。
常见范围: 筛选阈值常用 0.25 左右（不同 Seurat 版本默认值不同）；数值依赖归一化方式和伪计数，跨软件、跨版本不能直接比较。
相关章节: 标志基因与细胞注释

表达比例 pct.1 / pct.2 `pct.1 / pct.2`

湿实验来源: 受捕获效率影响：只有一部分 mRNA 被捕获，低表达基因在很多细胞里读到 0。
数据含义: pct.1 是本簇中检测到该基因（UMI ≥ 1）的细胞比例，pct.2 是其余细胞中的比例。环境 RNA 会抬高 pct.2。
常见范围: 0–1。理想标志基因 pct.1 接近 1、pct.2 接近 0。
相关章节: 标志基因与细胞注释

校正 p 值 `p_val_adj`

湿实验来源: 无直接湿实验来源。
数据含义: 多重检验校正后的 p 值；Seurat 的 p_val_adj 用 Bonferroni 法，按数据集中的全部基因数校正。细胞层面的检验把每个细胞当作独立样本，而簇本身又是用同一份数据定义的，所以 p 值会极小，只适合给标志基因排序，不能作为条件间差异的证据。
常见范围: 标志基因表里极小的 p 值很常见，这本身不代表生物学意义大。
相关章节: 标志基因与细胞注释

伪 bulk（pseudobulk）

湿实验来源: 对应实验设计中的生物学重复：每位供者或每个样本才是一个独立的单位。
数据含义: 把同一样本、同一细胞类型的细胞计数相加，得到“每样本一列”的矩阵，再用 DESeq2、edgeR 或 limma 做条件之间的比较，避免把细胞当独立重复造成的假阳性。
常见范围: 统计效力取决于样本数，而不是细胞数；每组只有一两个样本时不宜做推断。
相关章节: 标志基因与细胞注释 · 进阶

批次效应

湿实验来源: 不同日期、操作者、解离流程、芯片批次、化学版本或测序运行带来的系统性差异。
数据含义: 同一种细胞按样本分开成几团。Harmony、Seurat CCA/RPCA、scVI 等整合方法在低维空间里对齐样本；如果条件与批次完全混杂，任何方法都分不清两者。
常见范围: 最好的校正发生在实验设计阶段：让每个批次都包含各组样本。
相关章节: 进阶

拟时序

湿实验来源: 无直接湿实验来源；它依赖于样本里恰好捕获到连续过程的各个阶段。
数据含义: 细胞沿着拟合出的路径到起点的距离，表示它在这个过程中走了多远；它是按相似性排序，不是真实时间。起点需要用生物学知识指定。
常见范围: 通常缩放到 0–1 或任意单位，不同轨迹之间不能直接比较。
相关章节: 进阶

RNA 速率

湿实验来源: 3′ 试剂盒主要捕获成熟 mRNA；未剪接 reads 多来自内含子中富含 A 区段的内部引发，以及正在加工的新生转录本。
数据含义: 比较每个基因的未剪接与已剪接计数：未剪接相对多，说明基因正在开启；相对少，说明正在关闭。需要从 BAM 或 FASTQ 另行计数（velocyto、STARsolo、alevin-fry），标准计数矩阵里没有这种拆分。
常见范围: 模型假设（剪接与降解速率恒定等）经常不成立；二维图上的箭头对投影方式很敏感。
相关章节: 进阶

配体–受体分析

湿实验来源: 解离破坏了细胞在组织中的空间位置，所以数据本身不知道两个细胞是否相邻。
数据含义: 根据已知配体–受体对数据库，给“发送方表达配体、接收方表达受体”的组合打分（CellChat、CellPhoneDB、LIANA 等）。结果是候选列表，依赖数据库，RNA 也不等于蛋白。
常见范围: 需要空间转录组、蛋白或功能实验验证；比较条件需要生物学重复。
相关章节: 进阶

CNV 推断

湿实验来源: 无直接湿实验来源；要求样本中同时捕获到足够的正常细胞（免疫或基质细胞）作为参照。
数据含义: 把基因按染色体位置排列，对表达做滑动平均，再与正常参照细胞比较，大片段的扩增和缺失提示恶性细胞（inferCNV、CopyKAT、Numbat 等）。
常见范围: 只能看到大片段（染色体臂级）事件；参照细胞最好来自同一位患者。
相关章节: 进阶

全外显子测序 WES

肿瘤纯度

湿实验来源: 肿瘤组织里混有间质、免疫细胞和正常上皮。取材部位、病理圈选和宏观切割（macrodissection）决定送检 DNA 中有多少来自肿瘤细胞。
数据含义: 样本中肿瘤细胞所占的比例。它直接压低 VAF：二倍体区域的克隆性杂合突变，期望 VAF ≈ 纯度 / 2。
常见范围: 病理估计（肿瘤细胞核比例）与计算估计（ABSOLUTE、FACETS、PureCN、Sequenza 等，基于 VAF 和拷贝数）常不一致。纯度 20% 时克隆性杂合突变的期望 VAF 只有约 10%，检出能力明显下降。
相关章节: 样本 · 体细胞突变检测 · 进阶

倍性

湿实验来源: 不来自实验操作，而是肿瘤本身的基因组状态：染色体获得、丢失和全基因组加倍。
数据含义: 肿瘤细胞的平均拷贝数。它和纯度一起决定 VAF 与真实克隆比例之间的换算，通常与纯度联合估计。
常见范围: 正常细胞为 2；发生全基因组加倍的肿瘤接近 4。成人 AML 中有相当一部分核型正常，拷贝数改变比多数实体瘤少。
相关章节: 样本 · 进阶

配对正常样本

湿实验来源: 同一患者的非肿瘤 DNA，实体瘤通常取外周血。血液肿瘤的血里本身含肿瘤细胞，需要换用其他组织，例如 TCGA-LAML 用皮肤活检（Ley 等，NEJM 2013）。
数据含义: 用来扣除胚系变异：肿瘤里有、正常里没有的变异才是体细胞候选。正常样本里混入肿瘤细胞会让真实突变被当成胚系过滤掉。
常见范围: 正常样本常测得比肿瘤浅。没有正常样本的 tumour-only 模式只能依靠 panel of normals 和人群频率库，假阳性明显更多。
相关章节: 样本 · 体细胞突变检测

胚系变异

湿实验来源: 遗传自父母，存在于身体每一个细胞中，所以血、皮肤和肿瘤里都测得到。
数据含义: 在正常样本中 VAF 约 50%（杂合）或约 100%（纯合）。一个人的外显子组相对参考基因组就有上万个胚系变异，体细胞分析必须把它们扣掉。
常见范围: 杂合位点在肿瘤中偏离 50%，提示该区域有拷贝数改变或杂合性丢失（LOH）。
相关章节: 样本 · 体细胞突变检测

体细胞突变

湿实验来源: 出生后在某个细胞里获得，只传给它的后代细胞，因此只存在于肿瘤（或其中的亚克隆）中。
数据含义: 肿瘤中有、配对正常中没有的变异。VAF 取决于纯度、拷贝数和克隆比例。
常见范围: 随肿瘤类型差别很大：每个外显子组从几个到上千个。TCGA-LAML 每个样本的非同义突变中位数约为 9 个。
相关章节: 样本 · 体细胞突变检测

FFPE 假象

湿实验来源: 福尔马林固定造成交联和断裂，并使胞嘧啶脱氨成尿嘧啶。尿嘧啶在 PCR 中按 T 复制，于是出现 C>T（另一条链上为 G>A）。固定时间长、蜡块存放久都会加重。
数据含义: 大量低 VAF 的 C>T 候选，并带读段方向偏好。用 orientation bias 过滤、panel of normals 和突变谱检查来识别。
常见范围: 主要集中在低 VAF。建库前用尿嘧啶 DNA 糖基化酶（UDG）处理可以明显减少。新鲜冷冻样本和血样基本没有这类假象。
相关章节: 样本 · 体细胞突变检测 · 突变谱与突变特征

DNA 完整性

湿实验来源: 取决于样本类型和处理：血和新鲜冷冻组织片段长，FFPE 片段短而且受损。建库前用片段分析仪（如 TapeStation 的 DIN）或长短扩增子的 qPCR 比值评估。
数据含义: 完整性差会带来更短的插入片段、更低的文库复杂度、更高的重复率和更多 C>T 假象。
常见范围: DIN 取值 1–10，越高越完整，FFPE 常明显偏低。放行阈值由各实验室根据自己的流程验证。
相关章节: 样本 · 建库与外显子捕获

克隆性造血

湿实验来源: 随年龄增加，血液中常出现携带体细胞突变（常见于 DNMT3A、TET2、ASXL1）的造血干细胞克隆。用血作正常对照时，这些突变会出现在正常样本里。
数据含义: 肿瘤样本里浸润的血细胞也可能带着这些突变，被误当成肿瘤突变；或者因为正常样本里也有，真实信号被扣掉。
常见范围: 检出率随年龄和测序深度上升，多为低 VAF。
相关章节: 样本

插入片段长度 `MEDIAN_INSERT_SIZE`

湿实验来源: 由打断（超声或酶切）和片段筛选决定，是两个接头之间那段基因组 DNA 的长度。FFPE DNA 本身就碎，插入片段更短。
数据含义: 从双端 reads 比对位置推算。插入片段短于读长时，两端 reads 重叠甚至读进接头，重叠部分的碱基不能算两次。
常见范围: WES 常见约 150–250 bp，取决于打断条件和片段筛选。
相关章节: 建库与外显子捕获 · 比对

文库复杂度 `ESTIMATED_LIBRARY_SIZE`

湿实验来源: 文库里独立原始分子的数量。DNA 投入少、DNA 受损（FFPE）或连接效率低，复杂度就低。
数据含义: 复杂度低时，加测只会读到更多重复，有效深度不再增加。Picard 会给出估计文库大小。
常见范围: 没有通用阈值；同一试剂盒、同类样本之间比较最有意义。
相关章节: 建库与外显子捕获 · 测序与覆盖深度

重复率 `PERCENT_DUPLICATION`

湿实验来源: PCR 扩增把同一个原始分子复制成多份（PCR 重复）；有图案的 flow cell 上相邻簇也会读到同一个分子（光学重复）。
数据含义: 两端比对起点相同的 read 对被标记为重复，只留一条参与变异检测。重复不提供独立证据，会虚高深度。
常见范围: 随 DNA 投入量、样本质量和测序深度而变：同一文库测得越深，重复率越高；低投入和 FFPE 文库更高。应与同批、同试剂盒样本比较。
相关章节: 建库与外显子捕获 · 测序与覆盖深度 · 比对

捕获区大小

湿实验来源: 由外显子试剂盒的探针设计决定，写在试剂盒提供的目标区域 BED 文件里。
数据含义: 目标区域的总长度（Mb），是 TMB 的分母。更严格的分母是实际可检出的区域：肿瘤和正常都覆盖足够的那部分。
常见范围: 常见外显子试剂盒约 30–60 Mb，随试剂盒及是否包含 UTR、是否计入两侧延伸而变。maftools 的 tcgaCompare 默认把 TCGA 按 35.8 Mb 计，tmb() 不填时默认 50 Mb。
相关章节: 建库与外显子捕获 · 肿瘤突变负荷 TMB

在靶率 `PCT_SELECTED_BASES`

湿实验来源: 反映杂交捕获的效率和特异性：探针设计、杂交与洗涤的严格程度、插入片段长度和多文库混合捕获都会影响它。
数据含义: 落在目标区（或其附近）的读段或碱基比例。偏低意味着测序量浪费在脱靶区，有效深度不足。
常见范围: 依试剂盒和计算口径（是否计入近靶区）差别很大，应与同一试剂盒的历史数据比较。
相关章节: 建库与外显子捕获 · 测序与覆盖深度

目标区平均深度 `MEAN_TARGET_COVERAGE`

湿实验来源: 取决于每个样本分到的测序量、在靶率和重复率。
数据含义: 目标区每个碱基平均被多少条 read 覆盖，通常已去掉重复和低质量 reads。平均值会掩盖覆盖不均。
常见范围: 肿瘤 WES 常见约 100–200×，正常样本常更浅。所需深度取决于纯度和想检出的最低 VAF。
相关章节: 测序与覆盖深度

≥20× 目标碱基比例 `PCT_TARGET_BASES_20X`

湿实验来源: 同时取决于总测序量和捕获的均一性：均一性差时，即使平均深度高，也有一部分外显子覆盖不足。
数据含义: 目标区中深度至少 20× 的碱基所占比例，说明有多少区域达到了基本可检出的深度。
常见范围: 20× 是常用参考线，肿瘤低 VAF 检测还应看 50× 或 100× 的比例。具体要求依项目而定。
相关章节: 测序与覆盖深度

覆盖均一性 `FOLD_80_BASE_PENALTY`

湿实验来源: 高 GC 和低 GC 区域的杂交效率与 PCR 扩增效率都偏低，探针设计和文库复杂度也有影响。
数据含义: 各外显子深度是否接近。常用 Picard 的 FOLD_80_BASE_PENALTY：要让 80% 的目标碱基达到平均深度，还需加测多少倍，越接近 1 越均匀。
常见范围: 另有 GC_DROPOUT、AT_DROPOUT 反映 GC 偏好。数值应与同一试剂盒的历史数据比较。
相关章节: 建库与外显子捕获 · 测序与覆盖深度

碱基质量

湿实验来源: 测序仪在每个循环判读碱基时给出的置信度。读长后段、簇密度过高或试剂问题都会使质量下降。
数据含义: Phred 值 Q = −10·log10(错误率)：Q20 表示 1% 错误，Q30 表示 0.1%。低质量碱基在变异检测中权重低或被忽略。
常见范围: Illumina 用 ≥Q30 碱基比例作运行质控指标，规格随平台和读长而定。
相关章节: 测序与覆盖深度 · 比对

比对质量 MAPQ `MAPQ`

湿实验来源: 不来自实验操作，而来自基因组本身：重复序列、假基因和同源基因家族让短 read 找不到唯一位置。插入片段越短、读长越短，问题越明显。
数据含义: 比对位置正确的置信度（Phred 值）。BWA 对能同样好地比对到多处的 read 给 0。变异检测会忽略 MAPQ 很低的 reads，所以这些区域实际不可检出。
常见范围: BWA-MEM 最高为 60。PMS2、CYP2D6 等有高度同源假基因的区域常年低 MAPQ。
相关章节: 比对 · 体细胞突变检测

碱基质量校正 BQSR

湿实验来源: 测序仪报告的碱基质量存在系统偏差，随测序循环、相邻碱基和测序批次（lane）而变。
数据含义: GATK 在已知变异位点（dbSNP、已知 indel）之外统计实际错配率，按读段组、报告质量、循环和二核苷酸背景建模，重写每个碱基的质量值。reads 本身不变。
常见范围: 属于 GATK 最佳实践中比对之后、变异检测之前的步骤。
相关章节: 比对

变异等位基因频率 VAF `t_alt_count / (t_ref_count + t_alt_count)`

湿实验来源: 由样本组成决定：纯度、拷贝数、突变所在克隆的比例，以及 FFPE 等假象。
数据含义: 该位点上支持变异的 reads 数除以总 reads 数。胚系杂合位点约 50%；二倍体区域的克隆性杂合体细胞突变约为纯度 / 2。
常见范围: 受二项抽样影响：100× 时 VAF 为 25% 的位点，抽样标准差约 4 个百分点。拷贝数改变会让它偏离纯度 / 2。
相关章节: 测序与覆盖深度 · 体细胞突变检测 · 进阶

支持 reads 数 `t_alt_count`

湿实验来源: 取决于测序深度、文库复杂度（去重后剩多少独立分子）以及 VAF。
数据含义: 携带变异碱基的 reads 条数。支持太少的候选很难与测序错误区分，变异检测和过滤都会要求一定的最少支持数。
常见范围: 按二项分布，100×、VAF 5% 时平均只有 5 条支持 reads，要求至少 5 条，约一半的真实突变会漏掉。
相关章节: 测序与覆盖深度 · 体细胞突变检测

拷贝数改变

湿实验来源: 肿瘤基因组的片段获得或丢失，不是实验造成的。
数据含义: 改变突变等位基因与总拷贝的比例，从而改变 VAF。WES 也能粗略估计拷贝数（CNVkit、FACETS、PureCN、Sequenza 等），但比全基因组噪声大。
常见范围: 突变位于扩增的等位基因上时 VAF 高于纯度 / 2，位于未扩增的等位基因上时则更低。
相关章节: 体细胞突变检测 · 进阶

杂合性丢失 LOH

湿实验来源: 肿瘤细胞丢失了一对等位基因中的一个（缺失，或拷贝数不变的单亲二倍化）。
数据含义: 胚系杂合位点在肿瘤中不再是 50%。若剩下的那份携带体细胞突变，克隆性突变的 VAF 可接近纯度本身。
常见范围: 抑癌基因常见：一个等位基因突变，另一个丢失。
相关章节: 体细胞突变检测 · 进阶

正常样本集 PoN

湿实验来源: 用同一试剂盒、同一流程处理的一批正常样本建成，记录这个平台反复出现的技术假象。
数据含义: 在多个正常样本里都出现过的位点被标记，Mutect2 不再把它们当体细胞突变。它捕捉配对正常样本单独看不出来的系统性假象。
常见范围: 应与待分析样本的试剂盒和流程一致，通常需要数十个正常样本，越多越稳定。
相关章节: 体细胞突变检测

胚系人群频率库

湿实验来源: 不来自本实验，而是大规模人群测序的汇总，例如 gnomAD。
数据含义: 给出每个变异在人群中的等位基因频率。Mutect2 用它作先验：人群中常见的变异更可能是胚系。正常样本测得浅或没有正常样本时尤其重要。
常见范围: 人群频率不是 VAF：前者是人群中的比例，后者是一个样本中 reads 的比例。
相关章节: 体细胞突变检测

读段方向偏好

湿实验来源: 建库前发生在原始 DNA 某一条链上的损伤：FFPE 的胞嘧啶脱氨（C>T），以及超声打断等过程中的鸟嘌呤氧化（8-oxoG，G>T）。
数据含义: 这类假象几乎只出现在某一种配对方向的 reads 中（F1R2 或 F2R1），真实突变两种方向都有。GATK 用 LearnReadOrientationModel 学习这种偏好，再由 FilterMutectCalls 过滤。
常见范围: FFPE 样本和长期保存的文库中更明显。
相关章节: 样本 · 体细胞突变检测

交叉污染

湿实验来源: 另一个人的 DNA 混进样本：取样、提取、移液、建库混样时都可能发生。样本标签错误则是另一类问题，需要单独核对。
数据含义: GATK 的 CalculateContamination 用常见胚系 SNP 估计污染比例：在纯合位点上出现的少量另一等位基因。污染会造成一批低 VAF 的假体细胞突变。
常见范围: 理想情况下接近 0。肿瘤与正常是否来自同一个人，用两者胚系基因型的一致性检查（如 Conpair、NGSCheckMate）。
相关章节: 体细胞突变检测

VEP 注释

湿实验来源: 纯计算步骤，不涉及实验。
数据含义: Ensembl Variant Effect Predictor：判断每个变异落在哪些转录本上、产生什么后果（错义、终止获得、移码、剪接……），并可加入人群频率等注释。vcf2maf 调用它，再为每个变异选一个转录本写入 MAF。
常见范围: 同一个变异在不同转录本上的蛋白改变可能不同，比较不同研究时先核对所用转录本。
相关章节: 注释与 MAF 文件

MAF 文件

湿实验来源: 纯计算产物：变异检测、过滤和注释之后的结果表。
数据含义: Mutation Annotation Format，制表符分隔，每行是一个样本中的一个变异。关键列有 Hugo_Symbol、Chromosome、Start_Position、Reference_Allele、Tumor_Seq_Allele2、Variant_Classification、Variant_Type 和 Tumor_Sample_Barcode。
常见范围: MAF 只列出有变异的样本：已测序但没有任何突变的样本不会出现，分母要另外记录。
相关章节: 注释与 MAF 文件 · 突变与预后

变异分类 `Variant_Classification`

湿实验来源: 纯计算注释，不涉及实验。
数据含义: MAF 中描述变异后果的列，常见取值有 Missense_Mutation、Nonsense_Mutation、Frame_Shift_Del/Ins、In_Frame_Del/Ins、Splice_Site、Silent。
常见范围: 各类之间的比例本身就是质控：例如 Silent 或非编码类别异常多，可能是过滤不足。
相关章节: 注释与 MAF 文件 · 队列突变全景

非同义突变

湿实验来源: 纯计算定义，不涉及实验。
数据含义: 改变蛋白序列的编码突变。maftools 默认把 9 类计为非同义：Missense、Nonsense、Frame_Shift_Del/Ins、In_Frame_Del/Ins、Splice_Site、Translation_Start_Site、Nonstop_Mutation；Silent 等另存，不计入。
常见范围: 定义直接影响 TMB 的分子：有些检测把同义突变也计入。
相关章节: 注释与 MAF 文件 · 肿瘤突变负荷 TMB

Oncoplot

湿实验来源: 纯分析图形，但每个格子都依赖前面的捕获、深度和过滤：某个基因覆盖差，它在 oncoplot 上就会偏少。
数据含义: 基因为行、样本为列，格子颜色表示突变类型。基因按突变频率排序，样本排序使共现与互斥呈阶梯状。
常见范围: 右侧百分比的分母是 MAF 中的样本数；没有突变记录的已测序样本若不在 MAF 里，频率会被高估。
相关章节: 队列突变全景

互斥与共现

湿实验来源: 不来自实验，是肿瘤演化的结果：同一通路被打一次往往就够了。
数据含义: 两个基因很少（互斥）或格外常（共现）在同一样本中突变。maftools 的 somaticInteractions 对每对基因做 Fisher 精确检验，需做多重检验校正。
常见范围: 受突变负荷混杂：超突变样本同时携带很多基因的突变，会虚增共现。
相关章节: 队列突变全景 · 驱动基因与热点

肿瘤突变负荷 TMB `mut/Mb`

湿实验来源: 分母由捕获试剂盒和覆盖决定，分子受纯度、深度和过滤影响。同一肿瘤在不同平台上测得的 TMB 可能不同。
数据含义: 每 Mb 可检出区域内的体细胞突变数。WES 常用非同义突变除以捕获区大小。
常见范围: 随肿瘤类型跨越几个数量级，AML 在最低端。10 mut/Mb 来自 FDA 依据 KEYNOTE-158 对 FoundationOne CDx 的批准，是 panel 口径，不能直接套用到 WES 的非同义 TMB 上。
相关章节: 建库与外显子捕获 · 肿瘤突变负荷 TMB

转换/颠换比 Ti/Tv

湿实验来源: FFPE 脱氨会抬高 C>T（转换），8-oxoG 氧化会抬高 C>A（颠换），所以样本处理会改变这个比值。
数据含义: 转换（嘌呤↔嘌呤、嘧啶↔嘧啶，即 C>T、T>C）与颠换（其余四类）的数量之比。
常见范围: 胚系 SNV 的经验值：全基因组约 2.0–2.1，外显子约 2.8–3.0。这些数值不适用于体细胞突变，体细胞的 Ti/Tv 由突变过程决定。
相关章节: 突变谱与突变特征

96 类三核苷酸突变谱

湿实验来源: 反映致突变过程（衰老、紫外、烟草、APOBEC、修复缺陷），也会混入 FFPE、8-oxoG 等实验假象。
数据含义: 以嘧啶为参照的 6 类单碱基替换，乘以 5′ 和 3′ 两侧各 4 种碱基，共 6 × 16 = 96 类。
常见范围: 需要参考基因组取侧翼碱基；WES 每个样本的 SNV 往往较少，单样本谱噪声大。
相关章节: 突变谱与突变特征

突变特征

湿实验来源: 每种致突变过程在 96 类上留下特定的比例模式；实验假象也会形成自己的模式。
数据含义: 用非负矩阵分解（NMF）从队列突变谱中提取，或把已知特征拟合到样本上，再与 COSMIC 目录按余弦相似度比对。
常见范围: 例如 SBS1 与 5-甲基胞嘧啶自发脱氨（时钟样）有关，SBS2/SBS13 与 APOBEC 有关，SBS4 与烟草有关。余弦相似度达到约 0.85 以上才常被视为可信匹配，这是经验约定。
相关章节: 突变谱与突变特征

突变热点

湿实验来源: 不来自实验。但某些热点（如长度不一的 FLT3-ITD）在短读长数据里难以检出，检出率受读长和插入片段影响。
数据含义: 在多个患者中反复命中的同一个氨基酸位点，通常是功能获得型突变的标志，是驱动突变的强证据。
常见范围: AML 中的经典例子：IDH1 R132、IDH2 R140/R172、DNMT3A R882、NPM1 第 12 外显子移码插入、FLT3 D835。
相关章节: 驱动基因与热点

错误发现率 FDR

湿实验来源: 统计概念，不涉及实验。
数据含义: 同时检验很多基因时，被判为显著的结果中假阳性所占的期望比例。常用 Benjamini–Hochberg 方法把 p 值换算成 q 值。
常见范围: 常用阈值 q 小于 0.05 或 0.1。排序和标注应依据 q，而不是原始 p。
相关章节: 队列突变全景 · 驱动基因与热点 · 进阶

野生型

湿实验来源: 前提是这个样本确实测过，而且该基因覆盖足够；未测序或覆盖不足的样本不能算野生型。
数据含义: 在某个基因上没有非同义突变的已测序样本。MAF 里完全没有记录的已测序样本也属于野生型，而不是缺失值。
常见范围: TCGA-LAML：MAF 有 193 个样本，临床表 200 行；有临床信息但没有 MAF 记录的样本，在生存分析中计为野生型。
相关章节: 突变与预后

log-rank 检验

湿实验来源: 统计概念，不涉及实验。
数据含义: 比较两条或多条 Kaplan–Meier 曲线整体是否不同。它只给 p 值，不给效应大小；效应大小看 Cox 模型的风险比（HR）。
常见范围: 每位患者一行；任一组少于 10 人或少于 10 个事件时，结果不稳定。
相关章节: 突变与预后

癌细胞比例 CCF

湿实验来源: 不能直接测量，要从 VAF、纯度和拷贝数推算。
数据含义: 携带某个突变的肿瘤细胞所占比例：接近 1 为克隆性，明显小于 1 为亚克隆。常用工具有 PyClone、SciClone、ABSOLUTE。
常见范围: CCF = VAF × (纯度 × 肿瘤拷贝数 + 2 × (1 − 纯度)) / (纯度 × 突变拷贝数)。纯度或拷贝数估错，CCF 跟着错。
相关章节: 进阶

MATH 分数

湿实验来源: 受纯度和测序深度影响：深度越浅，VAF 抽样越分散，MATH 越高。
数据含义: Mutant-Allele Tumour Heterogeneity：100 × MAD(VAF) / median(VAF)，MAD 乘以 1.4826 校正。VAF 越分散，异质性越高（Mroz 与 Rocco 2013，头颈癌）。
常见范围: 描述性指标，只在同一检测、同一流程的样本之间比较；突变数很少时不稳定。
相关章节: 进阶