建库与测序：read 的结构

从 cDNA 到测序文库

建库大致分四步：

1. cDNA 扩增与质检：PCR 扩增后检查片段大小分布和产量。cDNA 产量低，往往意味着细胞少或细胞的 RNA 含量低。
2. 片段化：用酶把长 cDNA 打断成适合测序的长度。
3. 末端修复、加 A 尾、连接接头：在片段末端连上带 Read 2 引物序列的接头。
4. 样本 index PCR：加上与流动槽结合所需的 P5/P7 序列，以及区分样本的样本 index。

关键在第 4 步。只有一端带着凝胶珠引物（Read 1 序列、条形码、UMI）、另一端带着 Read 2 接头的片段，才能被这一轮 PCR 正确扩增。来自 cDNA 中间的片段两端都没有 Read 1 序列，扩增不起来。所以最终文库里几乎全是转录本的 3′ 端，这就是“3′ 测序”名字的由来。

边合成边测序：一条 read 的结构

在 Illumina 流动槽上，文库分子的两端与槽面上的引物结合，经桥式扩增形成成千上万个相同拷贝组成的“簇”。测序时每个循环加入一个带荧光、末端暂时封闭的碱基，相机记录每个簇的颜色，切掉荧光和封闭基团，再进入下一个循环。一个循环读一个碱基。

以 3′ v3/v3.1 为例，一个文库分子被分成几段读出：

• Read 1（28 个循环）：16 bp 细胞条形码 + 12 bp UMI。它不含任何基因信息。
• i7 / i5 index：样本 index，单 index 试剂盒为 8 bp，双 index 试剂盒各 10 bp。
• Read 2：cDNA 序列，用来比对到基因，常用长度约 90 bp（以说明书为准）。

示例数据 pbmc3k 的 v1 文库排布不同：据 10x 的数据集说明，cDNA 在 98 bp 的 Read 1 中，14 bp 条形码在 index read 中读出，10 bp UMI 在 Read 2 中。比较不同年代的数据时，别想当然地套用 v3 的结构。

测序质量用 Q30 衡量：碱基质量值 ≥ 30，即错误率 ≤ 0.1%。质量通常随循环数增加而下降。

常见误区

• Read 1 测得太短。 Read 1 必须覆盖条形码 + UMI 的全长，少测几个循环就会截断 UMI。
• 只看总 reads 数。 Mean Reads per Cell 的分子里包括空液滴的 reads；环境 RNA 多时，细胞真正分到的深度更少。
• 以为测得越深越好。 饱和度已经很高时，加测几乎不会再发现新分子。
• 多个样本混测时忽视 index 跳跃。 在图案化流动槽上混合大量样本，建议使用唯一双 index。