归一化：消除测序深度的差异

为什么不能直接比较原始计数

设想两个同类型的细胞，基因 A 的真实表达一样。第一个细胞所在的液滴捕获效率高、分到的 reads 多，总共 6,000 个 UMI；第二个只有 3,000 个。第一个细胞里基因 A 的计数大约会是第二个的两倍。如果直接比较原始计数，这个差别会被误读成表达差异。

细胞的总 UMI 数（文库大小）混合了三种来源：液滴里的捕获和逆转录效率（第 3 章）、测序深度（第 4 章），以及细胞真实的 RNA 含量。前两种是技术噪音，第三种是生物学，但从数据里很难把它们分开。

Seurat 默认的 LogNormalize 分两步：

1. 每个细胞的计数除以该细胞的总 UMI，再乘 10,000（即 CP10k）：每个细胞被缩放到相同的总量。
2. 取 log1p，即 log(1 + x)：压缩动态范围，让高表达基因不至于主导后续分析；加 1 是为了处理 0。

obj <- NormalizeData(obj, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)

在 pbmc3k 上检查深度效应

组件横轴是 QC 后每个细胞的文库大小，纵轴是表达量最高的 500 个基因的平均值，左边是原始 UMI，右边是缩放到每 10,000 之后（取对数之前），并标出 Spearman 相关系数 ρ。归一化前，文库越大，表达值越高，两者几乎同步；缩放之后，这种依赖基本消失。

剩下的少量相关不一定是失败。PBMC 里单核细胞本来就比淋巴细胞大、RNA 多，文库大小有一部分是真实生物学。这也说明了归一化的代价：缩放到相同总量，同时抹掉了细胞之间真实的 RNA 含量差异。

还要注意取对数这一步。第三个面板对 log1p 之后的值画了同样的图，相关明显回升：测得浅的细胞零值更多、计数更离散，对数变换会把这种差别重新带进来。这也是 SCTransform 这类方法想要解决的问题之一。

另一种常用方法是 SCTransform：对每个基因，用正则化负二项回归把计数对测序深度建模，取 Pearson 残差作为归一化后的值。它对深度效应校正得更彻底，并且直接给出后续使用的高变基因。对主要细胞类型而言，两种方法的结果通常相近。

常见误区

• 以为归一化能去掉一切技术因素。 它处理的是总量差异，环境 RNA、批次效应和细胞组成差异都还在。
• 盲目回归 percent.mt 或 nCount_RNA。 在 ScaleData 里回归这些变量，可能连同真实的生物学一起去掉。
• 把 CP10k 当作绝对表达量。 10,000 只是一个方便的尺度，归一化值只在细胞之间相对可比。
• 用 z 分数做差异分析。 缩放后的值放大了低表达基因的噪音，不适合计算倍数变化。