第 3 章湿实验与测序
细胞条形码、UMI 与逆转录
液滴里的凝胶珠溶解后，释放出大量引物。引物末端的 poly(dT) 抓住 mRNA 的 poly(A) 尾，逆转录把两个标签写进每一条 cDNA：细胞条形码说明“来自哪个细胞”，UMI 说明“是哪一个分子”。之后所有的计数，都建立在正确读出这两个标签的基础上。
凝胶珠上的引物
每颗凝胶珠上连着大量结构相同的寡核苷酸，从珠子一端起依次是：
- Illumina Read 1 引物序列：之后测序时 Read 1 从这里开始读。
- 细胞条形码：同一颗珠子上全部相同，不同珠子各不相同，来自预先定义的白名单。
- UMI：随机序列，同一颗珠子上的每条寡核苷酸都不一样。
- poly(dT)：一串 T，与 mRNA 的 poly(A) 尾配对，这就是 poly(dT) 捕获。
条形码和 UMI 的长度随化学版本而变：
| 化学版本 | 细胞条形码 | UMI |
|---|---|---|
| 3′ v1（示例数据 pbmc3k） | 14 bp | 10 bp |
| 3′ v2 | 16 bp | 10 bp |
| 3′ v3 / v3.1 | 16 bp | 12 bp |
本教程讲到具体结构时以目前常用的 v3/v3.1 为例，而 pbmc3k 是 2016 年用更早的 v1 化学产生的，请注意两者的差别。
逆转录、扩增与 UMI 去重
poly(dT) 与 poly(A) 尾配对后，逆转录酶沿着 mRNA 合成 cDNA，到达 mRNA 的 5′ 端时会多加几个碱基，一段模板转换寡核苷酸（TSO）与之配对，逆转录酶“换个模板”继续延伸。这样每条 cDNA 两端都有已知序列，可以统一做 PCR 扩增。
逆转录完成后，乳液被打破，所有液滴的 cDNA 混在一起。混合没有关系，因为每条 cDNA 已经带着自己的条形码。接着是 PCR 扩增，问题也在这里：不同分子扩增效率不同，一个分子可能变成 3 条 reads，另一个变成 30 条。如果直接数 reads，数到的是扩增效率，而不是分子数。
UMI 解决了这个问题。同一个分子的所有 PCR 拷贝共享同一个 UMI，于是同一细胞、同一基因、同一 UMI 的 reads 合并计为 1 个分子。计数矩阵里的每个数字都是 UMI 数。
还要知道，细胞里只有一部分 mRNA 分子能被捕获并成功逆转录。低表达的基因因此经常读到 0，这不等于细胞没有表达它。
常见误区
- 把 read 数当表达量。 单细胞 3′ 数据的计数单位是 UMI，reads 数主要反映扩增和测序深度。
- 把 0 当成“不表达”。 捕获是不完全的，低表达基因的 0 多数是没捕获到。
- 期待 3′ 数据回答异构体或突变问题。 reads 集中在转录本 3′ 端，大多数剪接异构体看不清，远离 3′ 端的突变也测不到；这类问题需要全长或靶向方法。
- 混用不同化学版本的参数。 条形码长度、白名单和 read 结构都不同；Cell Ranger 通常会自动识别化学版本，自动识别失败时要核对。