第 1 章湿实验与测序

组织解离：从组织到单细胞悬液

单细胞测序的第一步不在测序仪上，而是把一块组织拆成一个个完整、存活、彼此分开的细胞。这一步决定了哪些细胞能进入数据，也会在每个细胞的转录组上留下实验的“指纹”。示例数据 pbmc3k 是外周血单个核细胞（PBMC），经密度梯度离心分离，不需要酶解；但几乎所有实体组织都要经过这一步。

酶解与机械解离

实体组织里的细胞靠细胞外基质和细胞连接粘在一起。常见做法是在 37 °C 用胶原酶、胰酶等消化基质，同时吹打、剪切或用自动解离仪施加机械力，再过滤去掉团块，必要时裂解红细胞（残留的红细胞会以血红蛋白基因比例的形式出现在数据里），去除碎片和死细胞。

这个过程有两个副作用：

应激转录：消化期间细胞仍然活着、仍在转录，FOS、JUN、EGR1、HSPA1A 等即早基因和热休克基因会被迅速诱导。数据里看到的是“解离之后的细胞”，不完全是它在组织里的状态。
选择性丢失：脆弱或特别大的细胞（如神经元、脂肪细胞、心肌细胞、部分上皮细胞）更容易破碎或被滤掉，免疫细胞则相对耐受。所以单细胞数据里的细胞类型比例，不能直接当作组织里的比例。

解离、冻存复苏和上机前的等待都会损伤细胞膜。膜一旦破损，胞质里的 mRNA 就会漏出去；线粒体有自己的膜，里面的线粒体转录本却留了下来。于是这个细胞的 UMI 数和基因数都变少，来自线粒体基因的比例反而升高。

漏出去的 mRNA 并没有消失。它们漂在悬液里，之后会和细胞一起被包进每一个液滴，成为环境 RNA（soup），给所有细胞叠加一层相同的背景表达。

上机前测得的细胞活率就是对这一切的预告：活率越低，数据里要剔除的细胞越多，背景污染也越重。