进阶：批次、轨迹、通讯与预后

多个样本：批次整合

不同日期、不同解离流程、不同芯片或化学版本处理的样本，即使细胞类型相同，表达也会有系统性差异，同一种细胞在 UMAP 上按样本分成几团，这就是批次效应。Harmony、Seurat CCA/RPCA、scVI 等方法在低维空间里把各样本的同类细胞对齐。

最常见的坑：整合会不会抹掉生物学差异？ 会，如果条件和批次混在一起。比如所有治疗组样本都在第二批处理，算法无法区分“批次”和“治疗”，可能把真实的治疗效应一并对齐掉。另外，整合修改的是嵌入（如 Harmony 校正的是 PC），不是计数；差异表达仍用原始计数，并以样本为单位（pseudobulk）。最好的批次校正发生在实验设计阶段：让每一批都包含各组样本。

动态过程：轨迹与 RNA 速率

轨迹与拟时序

如果样本里的细胞正处在一个连续过程的不同阶段（比如造血分化），可以按相似性把它们排成一条路径，每个细胞在路径上的位置就是拟时序。Monocle 3、Slingshot 等工具做的都是这件事。

最常见的坑：起点要靠生物学知识定。 算法只知道细胞之间的相似性，不知道哪一端是“早”，需要你用祖细胞标志基因、取样时间点或 RNA 速率指定起点。另外，算法总能在数据里拟合出一条路径，哪怕数据里没有连续过程。pbmc3k 主要是成熟的血细胞，在它们之间画轨迹并不代表分化。

RNA 速率

RNA 速率比较每个基因的未剪接和已剪接 reads：未剪接相对多，说明基因正在开启；相对少，说明正在关闭。由此推断每个细胞接下来的方向。

最常见的坑：它依赖 spliced/unspliced 计数，而这要额外生成。 标准的 Cell Ranger 矩阵不区分两者，需要从 BAM 或 FASTQ 用 velocyto、STARsolo 或 alevin-fry 另行计数。3′ 试剂盒主要捕获成熟 mRNA，未剪接 reads 多来自内含子中富含 A 区段的内部引发（第 3 章）。模型假设（如剪接和降解速率恒定）经常不成立，二维图上的箭头对投影方式很敏感，不能单独作为方向的证据。

细胞之间与细胞之内：通讯与 CNV

细胞通讯

CellChat、CellPhoneDB、LIANA 等工具查询已知的配体–受体对数据库，给“发送方表达配体、接收方表达受体”的组合打分。

最常见的坑：结果是候选，不是证据。 RNA 不等于蛋白；解离已经破坏了细胞的空间位置，数据不知道两个细胞是否真的相邻；结果还依赖所用的数据库。它适合产生假设，再用空间转录组、蛋白或功能实验验证。

恶性细胞与 CNV 推断

肿瘤细胞常有大片段的拷贝数变化。把基因按染色体位置排列，对表达做滑动平均，再与正常细胞比较，就能看到扩增和缺失，从而区分恶性细胞（inferCNV、CopyKAT、Numbat 等）。这就是 CNV 推断。

最常见的坑：需要正常参照细胞。 参照最好是同一位患者的免疫或基质细胞；没有参照、参照选错（如取自另一位患者或另一种组织），结果就会失真。CopyKAT 这类方法会尝试自动找出二倍体细胞，但前提仍是样本里有足够的正常细胞。它只能看到染色体臂级别的大片段事件；一组共调控的基因也可能被误读成拷贝数变化。

回到患者：细胞特征与预后

想知道某种细胞的比例或某个基因签名与生存的关系，先把每位患者的细胞汇总成一个数值，例如这类细胞占全部细胞的比例，或签名得分的平均值。

最常见的坑：生存分析必须先聚合到每位患者一行。 细胞永远不是生存检验的单位，否则几千个细胞会把同一位患者的随访重复几千次。分组阈值（如中位数）要在分析集确定之后再算；连续变量优先报告每个标准差的 Cox HR，高低分组的 KM 曲线只作展示；写明患者数和事件数。单细胞队列的患者数通常有限，结论更适合作为假设，在更大的 bulk 队列中验证。

常见误区

• 把这些方法的输出当成结论。 整合、轨迹、速率、通讯和 CNV 推断都依赖假设，结果都需要独立验证。
• 忘记统计单位。 跨条件、跨患者的比较，单位是样本或患者，不是细胞。
• 在不合适的数据上硬跑。 没有连续过程的数据不适合做轨迹，没有正常细胞的样本不适合做 CNV 推断。