微流控液滴：一个细胞一个反应室

细胞、凝胶珠和油在交汇处相遇

芯片上有三路液体：细胞悬液（混有逆转录试剂）、凝胶珠、分隔油。它们在交汇处被油切断成液滴，这种液滴叫 GEM。凝胶珠在液滴里溶解并释放引物，细胞裂解，逆转录就在这个小空间里完成。

关键在于两种东西进入液滴的方式不同。凝胶珠可变形、紧密排列，几乎是一颗接一颗地进入，所以大多数液滴恰好有一颗珠子。细胞则是随机到达的：一个液滴里有 0 个、1 个还是 2 个细胞，全凭运气。

泊松上样：空液滴与双细胞的取舍

细胞随机进入液滴，每个液滴里的细胞数服从泊松分布。设平均每个液滴有 λ 个细胞（上样越多，λ 越大），含 k 个细胞的液滴比例是 λ^ke^−λ/k!。拖动组件里的 λ，可以看到：

• λ 越大，空液滴越少，但含两个以上细胞的液滴增加得更快。
• λ 较小时，含细胞的液滴中多细胞的比例约为 λ/2，所以双细胞率大致随回收细胞数线性上升。经典 3′ v3/v3.1 说明书给出约每 1,000 个回收细胞 0.8%（回收 1 万个细胞约 7%–8%），具体以所用试剂盒说明为准。

按同样的公式算，即使在 λ = 1 这个“单细胞液滴最多”的位置，也只有约 37% 的液滴恰好装一个细胞，而含细胞的液滴里约 42% 是多细胞。所以实际上样总是故意稀释，宁可让大多数液滴空着。

另外，上样的细胞只有一部分会被回收成数据里的细胞（常见约一半到三分之二，依试剂盒而异），双细胞率要按回收数而不是上样数估计。

在数据里找回双细胞

两个不同类型的细胞（异型双细胞）落进同一液滴，看起来像一个“混合体”，比如同时表达 T 细胞和单核细胞的基因。scDblFinder、DoubletFinder 等方法的思路相同：随机抽两个细胞把表达相加，模拟出大量人工双细胞，再看每个真实细胞与这些模拟物有多像。

两点要记住。第一，双细胞只会在同一次捕获（同一个通道）内形成，所以检测要按样本分别运行。第二，两个同类型细胞组成的同型双细胞几乎无法从表达上识别，只能靠 UMI 偏高这类间接线索。实验上的补充办法是样本复用（cell hashing 或按供者基因型拆分），它能直接识别来自不同样本的双细胞。

常见误区

• 只用 UMI 上限代替双细胞检测。 单核细胞这类大细胞本来 UMI 就多；而很多双细胞并没有超过上限。
• 把所有样本合在一起跑双细胞检测。 跨通道的细胞不可能形成双细胞，合并运行会扭曲模拟和预期比例。
• 把过渡态细胞当成双细胞删掉。 正在分化的细胞可能同时表达两个谱系的基因；删除前先看它们是否连成连续的轨迹。