体细胞突变检测

在一个位点上数 reads

把覆盖同一位点的 reads 竖着叠起来，就是 pileup。数出其中带变异碱基的支持 reads，除以总 reads 数，就得到 VAF。肿瘤和正常并排看，三种情况一目了然：

• 两边都约 50%（或都约 100%）：胚系变异。
• 肿瘤中有、正常中几乎没有：体细胞突变候选。
• 只有寥寥几条 reads 支持，而且都朝同一个方向、都挤在 read 末端，或者都是低质量碱基：多半是假象。

Mutect2 以肿瘤–正常配对模式运行。它先找出可能有变异的活跃区域，在区域内对 reads 做局部组装，得到候选单倍型，再分别评估这个变异在肿瘤中存在的证据，以及它在正常样本中是否也存在。两份辅助资源帮它排除胚系变异和常见假象：

• 正常样本集（PoN）：用同一试剂盒、同一流程处理的一批正常样本，在其中反复出现的位点多半是技术假象。
• 胚系人群频率库（如 gnomAD）：人群中常见的变异更可能是胚系。正常样本测得浅时，这个先验尤其重要。

预期 VAF 与过滤：哪些是假象

在示意组件里调整纯度、深度和突变状态。正常样本里始终没有 alt reads；克隆性杂合突变在肿瘤中的期望 VAF 约为纯度 / 2，只存在于一半肿瘤细胞的亚克隆突变再减半。所以 VAF 15% 既可能是纯度 30% 的克隆性突变，也可能是纯度 60% 时的亚克隆突变，单看 VAF 分不出来。深度越浅，本次抽样看到的 VAF 离期望值越远。“两个拷贝（LOH）”这一项展示了杂合性丢失：带突变的那一份被保留下来，VAF 升到约等于纯度。更一般的拷贝数改变会让体细胞突变高于或低于纯度 / 2，也会让胚系杂合位点在肿瘤中偏离 50%。

Mutect2 之后，最佳实践还有三步：

1. LearnReadOrientationModel：利用 Mutect2 运行时收集的 F1R2/F2R1 计数，学习读段方向偏好，识别 FFPE 脱氨（C>T）和 8-oxoG 氧化（G>T）造成的假象。
2. CalculateContamination：以 GetPileupSummaries 在常见胚系 SNP 上的统计为输入，估计样本中混入他人 DNA 的比例，即交叉污染。
3. FilterMutectCalls：综合前两步的结果，再检查链偏好、支持 reads 是否太少、比对质量、变异是否总在 read 末端、是否与 PoN 或正常样本重合等，给每个候选标上 PASS 或具体的过滤原因。

常见误区

• 把 VCF 里每一行都当作突变。 只有 FILTER 为 PASS 的才通过了过滤，没通过的行仍然留在文件里。
• 借用别的平台的 PoN。 PoN 记录的是特定试剂盒和流程的系统假象，换了试剂盒就失去大部分作用。
• 把人群频率当成 VAF。 gnomAD 的频率描述人群，VAF 描述一个样本里的 reads，两者含义完全不同。
• 低 VAF 一律删除。 硬性的 VAF 下限会删掉低纯度样本和亚克隆里的真实突变，应先看方向偏好、支持 reads 和样本纯度。