测序与覆盖深度

双端测序与覆盖深度

Illumina 采用边合成边测序：文库分子在 flow cell 上原位扩增成簇，每个循环加入带荧光标记的碱基并成像，一个循环读出一个碱基。双端测序从片段两头各读一段（WES 常用 2×100 或 2×150 bp，依平台而定），两条 reads 比对后的距离给出插入片段长度。每个碱基都附带一个碱基质量值，越往 read 后段通常越低。

把 reads 铺到外显子上，逐个碱基数一数覆盖它的 reads，就得到深度曲线。这条曲线并不平：探针中心附近深、两端浅，GC 极端的外显子整体偏浅。重复 reads、比对质量低的 reads 和低质量碱基在变异检测时会被剔除，同一 read 对重叠的部分也只算一次，所以真正参与判断的有效深度低于原始深度。

深度决定能看见多低的 VAF

设一个位点的真实 VAF 为 f、深度为 n，支持变异的 reads 数近似服从二项分布：平均 n × f 条，但每次抽样都会有起伏。变异检测通常要求一定数量的支持 reads，以免把测序错误当成突变。于是，检出概率就是“抽到的支持 reads 不少于最低要求”的概率。

在上面的示意组件里试几组数字：

• 100×、VAF 5%、至少 5 条支持 reads：平均正好 5 条，检出概率只有约 56%。
• VAF 不变，深度提到 200×：检出概率约 97%。
• 100×、VAF 2%：检出概率只有约 5%；要可靠检出，需要 500× 量级的深度。

这里的 VAF 已经把纯度算进去了：纯度 30% 的样本里，克隆性杂合突变的期望 VAF 约 15%，亚克隆突变更低。所以纯度低的样本需要测得更深。

常见误区

• 只看平均深度。 平均 150× 也可能有一部分外显子只有 20×，要同时看 ≥20×（以及 ≥50×、≥100×）的比例和覆盖分布。
• 用原始深度估算灵敏度。 去掉重复和低质量 reads 之后的有效深度，才是变异检测真正用到的深度。
• 某个基因没检出突变，就当它是野生型。 先确认该位置的深度是否足够，覆盖不足的位置应视为“无法判断”。