样本：肿瘤与配对正常

配对设计：肿瘤里有、正常里没有

一块肿瘤组织从来不只含肿瘤细胞，间质、血管和浸润的免疫细胞都混在里面。肿瘤细胞所占的比例叫肿瘤纯度。配对的正常样本在实体瘤中通常取外周血，它只携带胚系变异。两相比较，肿瘤中有、正常中没有的变异，才是体细胞突变的候选。

血液肿瘤是例外：血里本身就有肿瘤细胞，不能当正常对照。本教程使用的 TCGA-LAML 改用皮肤活检作为正常样本（Ley 等，NEJM 2013）。

纯度为什么重要？设想一个突变存在于全部肿瘤细胞，只在两条同源染色体中的一条上，且该区域没有拷贝数改变。纯度 100% 时，一半的 DNA 拷贝带有突变，VAF 约 50%；纯度 40% 时，只有 40% 的细胞贡献突变拷贝，VAF 约 20%。也就是说，期望 VAF ≈ 纯度 / 2。拷贝数改变和倍性会打破这个关系，第 12 章再细讲。

FFPE：固定剂留下的假突变

临床样本大多是福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的。福尔马林让 DNA 交联和断裂，DNA 完整性随之下降；它还会让胞嘧啶脱去氨基变成尿嘧啶。尿嘧啶在 PCR 中被当作 T 复制，于是测序看到了一个并不存在的 C>T（在互补链上记为 G>A）。

这种损伤随机发生在原始 DNA 的某一条链上，因此有两个特征。第一，VAF 很低，因为同一位点只有少数分子受了损。第二，它几乎只出现在某一种配对方向的 reads 中，这就是读段方向偏好。真实突变在原始分子的两条链上都有，两种方向的 reads 都会出现。

常见误区

• 把 tumor-only 的结果当作体细胞突变。 没有配对正常样本时，只能靠人群频率库和 panel of normals 排除胚系变异，罕见的胚系变异会大量混进结果。
• 正常样本里混进了肿瘤细胞。 癌旁组织可能已有肿瘤细胞或癌前克隆，血液肿瘤用血作对照更是如此。真实突变在正常样本里也被看到时，会被当成胚系变异过滤掉。
• 只凭 VAF 阈值判断真假。 低 VAF 可能是 FFPE 假象，也可能是低纯度样本或亚克隆中的真实突变，要结合方向偏好和突变谱一起判断。